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Qu’est-ce que le séquençage à haut débit ?
Les technologies de séquençage à haut débit (HTS) permettent aux chercheurs de déterminer l’ordre des nucléotides dans l’ADN et de découvrir de nouvelles parties du génome plus rapidement et plus facilement que les méthodes précédentes. En 2001, les scientifiques ont achevé la première ébauche du génome humain en utilisant le séquençage de l’ADN Sanger, une méthode coûteuse et laborieuse lors du séquençage de grandes quantités d’ADN. Pour découvrir plus de détails sur le génome, les chercheurs se sont précipités pour concevoir et mettre en œuvre les technologies HTS.¹ Alors que les premières technologies HTS étaient plus rapides que les méthodes précédentes, elles étaient également moins précises et la plupart des chercheurs ont continué à utiliser des méthodes basées sur Sanger pour confirmer les variantes génétiques. Aujourd’hui, les méthodes HTS sont beaucoup plus précises et fiables et n’ont normalement plus besoin de confirmation secondaire.

Méthodes populaires de séquençage à haut débit
Séquençage Illumina
Le séquençage Illumina domine actuellement le marché HTS. Cette méthodologie consiste à ligaturer des séquences d’adaptateur à de plus petits morceaux d’ADN qui sont ensuite attachés à une lame de verre. Au cours de la réaction de séquençage, les ADN polymérases ajoutent des nucléotides marqués par fluorescence à chaque brin d’ADN naissant. Le séquenceur image les flashs de couleur résultants et enregistre le nucléotide correspondant. Ensuite, chaque fluorophore est éliminé par voie enzymatique et le processus est répété, amplifiant chaque brin d’ADN. Cette méthode génère de courtes lectures de séquences d’ADN qui sont alignées sur un génome de référence connu. Le séquençage Illumina est une méthode polyvalente qui peut être optimisée pour les besoins d’un chercheur. Par exemple, des séquences de séquençage plus lentes peuvent augmenter la précision, tandis que des séquences de séquençage plus rapides peuvent réduire la précision.^1,2

Ion-Torrent
La technologie Ion-Torrent utilise la PCR en émulsion pour amplifier les séquences d’ADN ligaturées par adaptateur à la surface des billes qui sont distribuées dans des micropuits. Lorsque les nucléotides se lient à un brin d’ADN en croissance, des ions hydrogène se libèrent dans le micropuits, modifiant le pH. Un capteur détecte ces changements de pH après chaque ajout de nucléotide, et la séquence est déterminée sur la base de ces informations. Étant donné que le séquençage Ion-Torrent n’utilise pas d’imagerie, cette technique augmente les vitesses de séquençage et réduit les coûts. Le séquençage Ion-Torrent génère également des lectures courtes similaires au séquençage Illumina, ce qui rend l’alignement difficile si la lecture la plus courte est située dans une séquence répétitive. Ion-Torrent est également dépendant de la PCR en émulsion qui, comme toute méthode de PCR, peut introduire des biais d’amplification car certaines séquences sont plus faciles à amplifier que d’autres.^1,3

Séquençage en temps réel d’une seule molécule (SMRT)
Dans le séquençage SMRT, les scientifiques coiffent les molécules d’ADN avec des adaptateurs en épingle à cheveux simple brin, et le séquençage s’ensuit sans plusieurs étapes d’amplification. Semblable au séquençage Illumina, la synthèse d’ADN se produit avec l’ajout de nucléotides fluorescents. Dans le séquençage SMRT, cependant, la réaction se produit au fond d’une très petite chambre. Lorsque les nucléotides se lient au brin d’ADN en croissance, la chambre empêche le bruit de fond et le signal fluorescent est imagé en temps réel par vidéo enregistrée et analysé pour révéler la séquence d’ADN. Cette méthode permet aux chercheurs de séquencer des morceaux d’ADN plus longs et permet des chevauchements plus importants entre les extrémités des molécules d’ADN, évitant ainsi le besoin d’un génome de référence. Les séquences d’ADN plus longues peuvent également couvrir l’ADN répétitif, ce qui permet aux chercheurs de couvrir une plus grande partie du génome.^1,4

Applications de séquençage à haut débit
Séquençage du génome entier
Avec leur grande taille et leurs nombreuses séquences répétées, les génomes entiers continuent de présenter les plus grands défis de séquençage. Les technologies Illumina et Ion-Torrent sont des exemples de séquençage à lecture courte et obligent les chercheurs à utiliser des génomes modèles lors de l’assemblage post-séquençage. Si la séquence d’un génome est déjà connue, ces technologies détectent rapidement et à peu de frais les variations à l’échelle du génome. Pendant ce temps, la technologie SMRT peut effectuer un séquençage à lecture longue, ce qui lui donne la capacité de générer des séquences qui se chevauchent, facilitant leur alignement. Sans avoir besoin d’un modèle, les chercheurs utilisent le séquençage SMRT pour assembler de nouveaux génomes d’espèces sous-étudiées.⁵

Séquençage de l’exome
Le séquençage de l’exome est la méthode de détection de variantes la plus rapide et la plus économique, et il fournit un moyen rapide de détecter les mutations héréditaires dans un cadre clinique. Les scientifiques peuvent uniquement isoler des brins d’ADN d’exome et les séquencer avec HTS. Par conséquent, seules les parties du génome codant pour les protéines sont séquencées, ce qui représente environ 1 % de l’ADN humain. Bien que cela puisse sembler être une infime fraction du génome, quatre-vingts pour cent des mutations de la maladie mendélienne se situent dans les séquences codant pour les protéines.^6,7

Séquençage d’ARN (RNA-seq)
En convertissant les molécules d’ARN en ADN à l’aide de la transcriptase inverse, les scientifiques utilisent les technologies HTS pour quantifier l’expression des gènes dans tout le génome. De nombreuses études se sont concentrées sur l’analyse en masse de l’ARN-seq, où l’ARN est extrait, séquencé et quantifié à partir de tissus entiers. Récemment, l’ARN-seq d’une seule cellule, où l’ARN est extrait et quantifié de chaque cellule individuelle d’un tissu, a fourni de nouvelles informations sur l’hétérogénéité tissulaire et la communication cellule-cellule.⁸

Interactions ADN-protéine/ADN-ADN (séquençage ChIP et Hi-C)
Les scientifiques utilisent également les technologies HTS pour déterminer les sites de liaison à l’ADN des protéines. Dans l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP), les protéines sont liées à leurs sites de liaison à l’ADN via la fixation. L’ADN est ensuite coupé en plus petits morceaux et un anticorps abaisse le complexe protéine-ADN. Après avoir séquencé les fragments d’ADN, les chercheurs peuvent identifier où une protéine se lie au génome.⁹ Les chercheurs utilisent une technique similaire appelée Hi-C pour déterminer les emplacements des interactions ADN-ADN liées par des protéines spécifiques. Une fois que les anticorps ont extrait ces protéines, les chercheurs séquencent les molécules d’ADN attachées et obtiennent un aperçu de la structure 3D du génome.^dix

Références

1. JA Reuter et al., « Technologies de séquençage à haut débit », Mol Cellule58:586-97, 2015.

   2. J. Guo et al., « Séquençage d’ADN à quatre couleurs avec des terminateurs réversibles de nucléotides modifiés en 3′-o et des didésoxynucléotides fluorescents chimiquement clivables », PNAS105:9145-50, 2008.

   3. JM Rothberg et al., « Un dispositif semi-conducteur intégré permettant le séquençage non optique du génome », La nature475:348-52, 2011.

   4. J. Eid et al., « Séquençage d’ADN en temps réel à partir de molécules de polymérase uniques », La science323:133-38, 2009.

   5. SL Amarasinghe et al., « Opportunités et défis dans l’analyse des données de séquençage à lecture longue », Génome Biol21h30, 2020.

   6. G. Lightbody et al., « Examen des applications du séquençage à haut débit en médecine personnalisée : obstacles et facilitateurs des progrès futurs dans la recherche et l’application clinique », Brève Bioinformer20:1795-1811, 2019.

   7. SM Rego et al., « Séquençage à haut débit et évaluation du risque de maladie », Perspect Med de Cold Spring Harb9, 2019.

   8. S. Chen et al., « Séquençage à haut débit de l’accessibilité du transcriptome et de la chromatine dans la même cellule », Nat Biotechnol37:1452-57, 2019.

   9. R. Mundade et al., « Rôle du chip-seq dans la découverte des sites de liaison des facteurs de transcription, du mécanisme de régulation différentielle des gènes, des marques épigénétiques et au-delà », Cycle cellulaire13:2847-52, 2014.

   10. K. Pal et al., « Analyse Hi-c : de la génération de données à l’intégration », Biophys Rev11:67-78, 2019.